Escuela de Doctorado

 
Tesis Doctorales de la Universidad Pablo de Olavide a partir de 2025/26
Optimización de nuevos sistemas CRISPR-Cas con propiedades mejoradas para la edición génica in vivo
Autor/aSANCHEZ BOLAÑOS, CARLOS
Director/aMORENO MATEOS, MIGUEL ANGEL
Fecha de depósito08-07-2026
Periodo de exposición pública8 a 22 de julio de 2026
Fecha de defensaSin especificar
ModalidadPresencial
ProgramaPrograma de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química (RD 99/2011)
Mención internacionalNo
ResumenLa edición génica basada en sistemas CRISPR-Cas ha revolucionado la biología molecular al permitir la modificación precisa y programable del genoma. Sin embargo, la aplicación de estas herramientas continúa limitada por factores como la dependencia de secuencias PAM específicas, la variabilidad en la eficiencia de edición y la limitada diversidad funcional de las nucleasas disponibles. En esta tesis doctoral se abordaron estas limitaciones mediante la evaluación y desarrollo de nuevos sistemas CRISPR-Cas con propiedades diferenciales para edición génica in vivo utilizando el pez cebra (Danio rerio) como modelo experimental.
En primer lugar, se caracterizaron las variantes SpG y SpRY derivadas de SpyCas9, evaluando su capacidad para expandir el repertorio de secuencias diana accesibles mediante el reconocimiento de PAMs no canónicos. Los resultados demostraron que ambas nucleasas permiten ampliar significativamente el espacio editable del genoma in vivo, aunque con eficiencias variables dependiendo del contexto de la diana y de las condiciones experimentales empleadas. Asimismo, se optimizaron distintos parámetros experimentales, incluyendo configuraciones de señales de localización nuclear y el uso de complejos ribonucleoproteicos (RNP), identificándose condiciones capaces de mejorar la eficiencia de edición en determinadas dianas.
En segundo lugar, se exploró el potencial funcional de nucleasas ancestrales reconstruidas evolutivamente a partir de SpyCas9. Estas nucleasas mostraron actividad in vivo y una elevada flexibilidad en el reconocimiento del PAM, aunque con eficiencias generalmente inferiores a las de las variantes modernas. El análisis funcional reveló que algunas de estas nucleasas, particularmente FCA, presentan un comportamiento predominantemente tipo nicasa, compatible con una funcionalidad reducida del dominio HNH. Los resultados obtenidos sugieren que, en el contexto embrionario temprano del pez cebra, los cortes monocatenarios pueden generar eventos mutagénicos mediante mecanismos asociados al colapso de la horquilla de replicación. Además, el diseño de nucleasas quiméricas permitió generar variantes con propiedades mejoradas, destacando ChiCas2 por su elevada actividad sobre PAMs no canónicos.
Finalmente, se realizó una primera caracterización funcional in vivo de los sistemas naturales DO1 Cas9 y DO2 Cas9, identificados a partir de metagenomas procedentes del océano profundo. Ambas nucleasas mostraron actividad en embriones de pez cebra y presentaron un comportamiento dependiente de la temperatura y del formato de administración empleado. Especialmente, DO1 Cas9 mostró una mayor actividad a bajas temperaturas cuando se utilizó en forma de complejos RNP, sugiriendo que factores relacionados con el ensamblaje y la traducción intracelular influyen de manera importante sobre su funcionalidad in vivo.
En conjunto, esta tesis demuestra que la combinación de estrategias basadas en ingeniería racional, reconstrucción evolutiva y exploración de sistemas naturales constituye una aproximación eficaz para expandir el repertorio funcional de herramientas CRISPR-Cas disponibles para edición génica in vivo. Además, los resultados obtenidos ponen de manifiesto la importancia del contexto biológico y celular en la actividad de estas nucleasas y aportan nuevas perspectivas para el desarrollo de sistemas CRISPR más versátiles y adaptados a distintas aplicaciones biotecnológicas y biomédicas.